1、血清睾酮测定：多数病例降低。据统计，47，XXY型患者79%降低，46,XY/47,XXY型患者33%降低，48,XXXY型、49,XXXYY型及49,XXXXY型患者中几乎全部降低。血清T水平降低的程度一般为轻度降低，严重降低者少见。血清性激素结合球蛋白(SHBG)水平升高，使具有生物活性的游离T更低。

2、血清促卵泡激素和黄体生成素测定：因为缺乏T对下丘脑和垂体的负反馈抑制作用，下丘脑和垂体功能活跃，垂体促性腺细胞分泌大量的FSH和LH。血清FSH 水平均增高，与正常人无重叠。FSH的显著增高间接提示曲精小管结构损坏和生精功能障碍。 血清LH水平，47,XXY型患者75%增高，46,XY/47,XXY型患者33%增高，48,XXXY型、49,XXXXYY型及49,XXXXY 型患者中绝大多数增高。

3、血清雌二醇测定：多数病例增高，有男性乳房发育的患者增高较为明显。

4、血清性激素结合蛋白测定：多数有不同程度的增高。

5、人绒毛膜促性腺激素试验：血清T对hCG-剌激的反应降低或正常。多数为不同程度的降低。

6、促性腺激素释放激素试验：血清LH及FSH对GnRH剌激的反应往往呈过强反应。

7、性染色质检查：具有两条或两条以上X染色体染色质(Barr小体)为阳性。

8、精液检查：典型病例表现为无精子，一些嵌合体如46,XY/47,XXY型患者可能表现为少精子症，其减数分裂存在不同程度障碍，停留在从初级精母细胞到精子细胞的各阶段，而一些曲精小管内甚至可能有正常的精子发生，即精液检查可基本正常。

9、性染色质检查和染色体检查：一般取外周血淋巴细胞做染色体G分带，方法简单。Barr氏小体检查快速可靠，其敏感性为82%，特异性95%。 Klinefeher综合征染色体核型的基本特征：至少有2个及2个以上X染色体和1个Y染色体。上述方法也可能得到正常的染色体核型，但不能排除组织特异的Klinefelter综合征嵌合型。某些嵌合型患者的异常染色体(染色体嵌合型)仅仅出现在睾丸中，外周血白细胞的核型可能是正常的，需要用培养皮肤成纤维细胞、或者睾丸活检样品来做染色体分析。

10、睾丸活检：典型组织学征象为曲细精管透明变性，生精细胞和Sertoli细胞缺如或显著减少。Leydig细胞增生，写呈假腺瘤或结节性增生。实际上，XXY男性胎儿期原始生精细胞是正常的、完整的，但在儿童期快速退化。这种现象是核型异常导致生精细胞本身的缺陷还是功能障碍的Sertoli细胞不能支持生精细胞的发育，抑或两者同时存在缺陷尚需进一步研究